忍冬种子萌发期间PAL活性及氯原酸含量变化
作者：张永清* 王丽萍 曾宪勇
单位：张永清* 王丽萍 山东中医药大学 济南 250014；曾宪勇 青州市卫生局
关键词：忍冬；种子萌发；PAL；氯原酸
中草药990828 摘 要 忍冬种子萌发期间PAL活性呈不断提高趋势，并在胚根与子叶突破或脱离种皮时出现两次高峰；氯原酸含量表现为持续提高，提高幅度不断加大。PAL活性变化与氯原酸含量变化并不同步但有密切关系。笔者还测定了幼苗不同器官中的PAL活性与氯原酸含量。
Changes of Phenylalanine Ammonia Lyase Activity and Chlorogenic Acid Content
of Japanese Honeysuckle Seeds (Lonicera japonica) During Germination
, 百拇医药
Zhang Yongqing, Zeng Xianyong and Wang Liping
(Shandong University of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica, Jinan 250014)
Abstract Changes of phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity and chlorogenic acid content of honeysuckle seeds during germination were studied. The results showed that the activity of phenylalanine ammonia lyase increased and two peaks occurred on the time when the radicle and cotyledon broke the seed coats, and the content of chlorogenic acid also increased but not synchronously. There was close relationship between phenylalanine ammonia lyase activity and chlorogenic acid content. The phenylalanine ammonia lyase activity and chlorogenic acid content in different organs of honeysuckle seedlings were determined.
, 百拇医药
Key words honeysuckle Lonicera japonica Thunb. seeds germination phenylalanine ammonia lyase (PAL) chlorogenic acid
忍冬Lonicera japonica Thunb.属忍冬科植物，为常用中药金银花与忍冬藤的主要原植物，在山东、河南等省有大面积种植。一般认为，氯原酸是金银花与忍冬藤的主要有效成分，并被作为评价药材与制剂质量的指标。氯原酸作为植物体次生代谢物质，来源于苯丙烷类代谢途径，在其生物合成过程中，苯丙氨酸解氨酶(PAL)是第一个关键酶和限速酶[1]。研究忍冬种子萌发期间PAL活性及氯原酸含量的变化，对于了解氯原酸的生物合成与积累规律，提高药材质量，有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料：采摘本校药用植物园种植的忍冬(Lonicera japonica Thunb.李建秀教授鉴定)植株成熟果实，清水漂洗去除果皮、果肉及瘪种，收集饱满种子，将水沥干，置室内通风处阴干备用。
, 百拇医药
1.2 方法：1)种子发芽：种子以0.1%HgCl2水溶液表面消毒15min后，用蒸馏水冲净，置培养皿中发芽，每100粒种子为1组，多次重复。发芽期间，每2天取3组种子测定PAL活性及氯原酸含量，取平均值作为结果。2)PAL活性测定：将种子置研钵中，加入在0～4℃温度下放置一段时间后的10 mL含5 mmol的巯基乙醇硼酸缓冲液、0.5g聚乙烯吡咯烷酮及少量石英砂，冰浴研磨，将匀浆抽滤，滤液在10 000r/min离心15min，取上清液测定酶活性，方法为1 mL酶液加10.02 mmol/L L-苯丙氨酸、2mL蒸馏水，对照以蒸馏水代替L-苯丙氨酸溶液，反应液置恒温水浴保温30 min后测定290 nm处的吸收度，以每小时吸收度变化0.01所需酶量为一个单位，酶活性以单位毫克蛋白质中的酶单位表示。蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[2]。3)氯原酸含量测定：取种子研细，加入一定量95%乙醇多次洗涤，完全转移于大试管中，用塑料布封口，在80℃水浴上连续提取2次，每次1.5h，提取液过滤后定容，测定333nm处的吸收度，以氯原酸纯品作对照绘制标准曲线、计算氯原酸含量。
, 百拇医药
2 结果与分析
2.1 PAL活性的变化：忍冬种子浸水后，经吸胀、裂口、胚根伸出、子叶脱离种皮等，最终完成萌发。其间种子PAL活性变化如图1。
图1 忍冬种子萌发过程中PAL活性的变化
图1表明，发芽初期种子的PAL活性较低，而后不断提高，在第6天出现第一个高峰，然后呈下降趋势，至第10天又开始上升，第14天达到第二个高峰。对照种子外部形态变化，发现PAL活性两次高峰的出现，恰恰发生在胚根与子叶突破或脱离种皮的时候，说明光照、氧气等因素对PAL活性的提高有刺激作用。
2.2 氯原酸含量的变化：忍冬干种子含有少量氯原酸，并且主要分布在种皮中[3]。发芽期间其氯原酸含量变化如图2所示。
图2 忍冬种子萌发过程中氯原酸含量的变化
, http://www.100md.com
发芽伊始，种子与水接触，因渗透和扩散作用，种皮中的氯原酸含量有所损失，结果种子中的氯原酸含量略有下降。从第2天开始，伴随着PAL活性的提高，氯原酸含量也不断提高，且提高幅度不断加大。
从忍冬种子发芽期间PAL活性与氯原酸含量的变化可以看出二者之间存在明显正相关，但PAL活性易受多种因素的影响发生显著变化，而合成后的氯原酸除不断代谢外尚有一定积累，含量呈逐步增加趋势。这也说明，氯原酸的生物合成除受PAL限制外，还受其它因素调节。
2.3 忍冬幼苗不同器官中的PAL活性及氯原酸含量：取胚轴长2～4cm、胚根长2～3cm、两片子叶完全展开并呈绿色的幼苗，分别测定不同器官PAL活性及氯原酸含量(表1)。
表1 忍冬幼苗不同器官中的PAL活性与氯原酸含量 器 官
子叶
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胚轴
胚根
氯原酸(%FW)
0.1706
0.0544
0.0496
PAL/mg.h
70.10
255.88
325.99
活性/g.FW.h
1 200.59
, 百拇医药
624.59
625.94
表1指出，子叶的氯原酸含量最高，胚轴和胚根较低，此结果与完整植株叶、茎与根中的氯原酸含量变化趋势相一致[4]。PAL活性因表示单位的不同有很大差异，以每小时单位毫克蛋白质中的酶单位(/mg.h)表示时，子叶PAL活性最低，胚轴居中，胚根最高；以每小时每克鲜重中的酶单位(/g.FW.h)来表示时，子叶PAL活性最高，其次是胚根和胚轴。所以如此，与子叶含有较多储存蛋白质密切相关。 参考文献
1 欧阳光察，等.植物生理学通讯，1988，(3)：9
2 肖伏蛾.湖南农学院学报，1987，(增刊)：145
3 张永清，等.山东中医学院学报，1991，15(2)：39
4 张永清，等.中国中药杂志，1996，21(4)：204
收稿日期：1998-10-19, http://www.100md.com(作者：张永清* 王丽萍 曾宪勇)
单位：张永清* 王丽萍 山东中医药大学 济南 250014；曾宪勇 青州市卫生局
关键词：忍冬；种子萌发；PAL；氯原酸
中草药990828 摘 要 忍冬种子萌发期间PAL活性呈不断提高趋势，并在胚根与子叶突破或脱离种皮时出现两次高峰；氯原酸含量表现为持续提高，提高幅度不断加大。PAL活性变化与氯原酸含量变化并不同步但有密切关系。笔者还测定了幼苗不同器官中的PAL活性与氯原酸含量。
Changes of Phenylalanine Ammonia Lyase Activity and Chlorogenic Acid Content
of Japanese Honeysuckle Seeds (Lonicera japonica) During Germination
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Zhang Yongqing, Zeng Xianyong and Wang Liping
(Shandong University of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica, Jinan 250014)
Abstract Changes of phenylalanine ammonia lyase (PAL) activity and chlorogenic acid content of honeysuckle seeds during germination were studied. The results showed that the activity of phenylalanine ammonia lyase increased and two peaks occurred on the time when the radicle and cotyledon broke the seed coats, and the content of chlorogenic acid also increased but not synchronously. There was close relationship between phenylalanine ammonia lyase activity and chlorogenic acid content. The phenylalanine ammonia lyase activity and chlorogenic acid content in different organs of honeysuckle seedlings were determined.
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Key words honeysuckle Lonicera japonica Thunb. seeds germination phenylalanine ammonia lyase (PAL) chlorogenic acid
忍冬Lonicera japonica Thunb.属忍冬科植物，为常用中药金银花与忍冬藤的主要原植物，在山东、河南等省有大面积种植。一般认为，氯原酸是金银花与忍冬藤的主要有效成分，并被作为评价药材与制剂质量的指标。氯原酸作为植物体次生代谢物质，来源于苯丙烷类代谢途径，在其生物合成过程中，苯丙氨酸解氨酶(PAL)是第一个关键酶和限速酶[1]。研究忍冬种子萌发期间PAL活性及氯原酸含量的变化，对于了解氯原酸的生物合成与积累规律，提高药材质量，有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料：采摘本校药用植物园种植的忍冬(Lonicera japonica Thunb.李建秀教授鉴定)植株成熟果实，清水漂洗去除果皮、果肉及瘪种，收集饱满种子，将水沥干，置室内通风处阴干备用。
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1.2 方法：1)种子发芽：种子以0.1%HgCl2水溶液表面消毒15min后，用蒸馏水冲净，置培养皿中发芽，每100粒种子为1组，多次重复。发芽期间，每2天取3组种子测定PAL活性及氯原酸含量，取平均值作为结果。2)PAL活性测定：将种子置研钵中，加入在0～4℃温度下放置一段时间后的10 mL含5 mmol的巯基乙醇硼酸缓冲液、0.5g聚乙烯吡咯烷酮及少量石英砂，冰浴研磨，将匀浆抽滤，滤液在10 000r/min离心15min，取上清液测定酶活性，方法为1 mL酶液加10.02 mmol/L L-苯丙氨酸、2mL蒸馏水，对照以蒸馏水代替L-苯丙氨酸溶液，反应液置恒温水浴保温30 min后测定290 nm处的吸收度，以每小时吸收度变化0.01所需酶量为一个单位，酶活性以单位毫克蛋白质中的酶单位表示。蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法[2]。3)氯原酸含量测定：取种子研细，加入一定量95%乙醇多次洗涤，完全转移于大试管中，用塑料布封口，在80℃水浴上连续提取2次，每次1.5h，提取液过滤后定容，测定333nm处的吸收度，以氯原酸纯品作对照绘制标准曲线、计算氯原酸含量。
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2 结果与分析
2.1 PAL活性的变化：忍冬种子浸水后，经吸胀、裂口、胚根伸出、子叶脱离种皮等，最终完成萌发。其间种子PAL活性变化如图1。
图1 忍冬种子萌发过程中PAL活性的变化
图1表明，发芽初期种子的PAL活性较低，而后不断提高，在第6天出现第一个高峰，然后呈下降趋势，至第10天又开始上升，第14天达到第二个高峰。对照种子外部形态变化，发现PAL活性两次高峰的出现，恰恰发生在胚根与子叶突破或脱离种皮的时候，说明光照、氧气等因素对PAL活性的提高有刺激作用。
2.2 氯原酸含量的变化：忍冬干种子含有少量氯原酸，并且主要分布在种皮中[3]。发芽期间其氯原酸含量变化如图2所示。
图2 忍冬种子萌发过程中氯原酸含量的变化
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发芽伊始，种子与水接触，因渗透和扩散作用，种皮中的氯原酸含量有所损失，结果种子中的氯原酸含量略有下降。从第2天开始，伴随着PAL活性的提高，氯原酸含量也不断提高，且提高幅度不断加大。
从忍冬种子发芽期间PAL活性与氯原酸含量的变化可以看出二者之间存在明显正相关，但PAL活性易受多种因素的影响发生显著变化，而合成后的氯原酸除不断代谢外尚有一定积累，含量呈逐步增加趋势。这也说明，氯原酸的生物合成除受PAL限制外，还受其它因素调节。
2.3 忍冬幼苗不同器官中的PAL活性及氯原酸含量：取胚轴长2～4cm、胚根长2～3cm、两片子叶完全展开并呈绿色的幼苗，分别测定不同器官PAL活性及氯原酸含量(表1)。
表1 忍冬幼苗不同器官中的PAL活性与氯原酸含量 器 官
子叶
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胚轴
胚根
氯原酸(%FW)
0.1706
0.0544
0.0496
PAL/mg.h
70.10
255.88
325.99
活性/g.FW.h
1 200.59
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624.59
625.94
表1指出，子叶的氯原酸含量最高，胚轴和胚根较低，此结果与完整植株叶、茎与根中的氯原酸含量变化趋势相一致[4]。PAL活性因表示单位的不同有很大差异，以每小时单位毫克蛋白质中的酶单位(/mg.h)表示时，子叶PAL活性最低，胚轴居中，胚根最高；以每小时每克鲜重中的酶单位(/g.FW.h)来表示时，子叶PAL活性最高，其次是胚根和胚轴。所以如此，与子叶含有较多储存蛋白质密切相关。 参考文献
1 欧阳光察，等.植物生理学通讯，1988，(3)：9
2 肖伏蛾.湖南农学院学报，1987，(增刊)：145
3 张永清，等.山东中医学院学报，1991，15(2)：39
4 张永清，等.中国中药杂志，1996，21(4)：204
收稿日期：1998-10-19, http://www.100md.com(作者：张永清* 王丽萍 曾宪勇)