中药联合长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌细胞周期及细胞增殖抗原的影响
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参见附件(1063kb)。
中药联合长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌细胞周期及细胞增殖抗原的影响
广州中医药大学第二临床医学院肿瘤科 吴万垠* 柴小姝 刘伟胜
摘 要： 目的 揭示中药消积饮、华蟾素联合长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌细胞周期的作用机制。方法 将90只皮下接种Lewis肺癌细胞的C57BL/6小鼠随机分成生理盐水阴性对照组(NS)、环磷酰胺治疗对照组(CTX)、消积饮组(XJY)、华蟾素组(HCS) 、长春瑞滨组(NVB)及其相应的组合(XH、XN、HN与XHN)，每组10只。给药7天后处死小鼠，比较各组小鼠的皮下瘤重，计算抑瘤率。运用FCM分析小鼠肿瘤细胞周期各时相分布的状况，并利用IHC计算PCNA阳性标记指数(PCNA-LI.%)。结果 各治疗组瘤重较NS组低(p<0.01)，抑瘤率分别是32.28%、44.44%、48.68%、51.32%、57.14%、58.73%、64.55%。XJY组的G0/G1期肿瘤细胞较生理盐水组比例增高(p<0.01)，HCS组的肿瘤细胞阻滞于S期，较生理盐水组比例增高(p<0.01)，NVB组的肿瘤细胞G2/M期细胞较生理盐水组比例增高(p<0.01)；XJY+HCS的肿瘤细胞G0/G1期、S期细胞比例较NS组均有所增高(p<0.01)，XJY+NVB的肿瘤细胞G0/G1期、G2/M期细胞比例较NS组均有所增高(p<0.01)，HCS+NVB的肿瘤细胞S期、G2/M期细胞比例较NS组略高(p>0.05)；XJY+HCS+NVB的肿瘤细胞G0/G1期细胞比例较其余所有组增高(p<0.01)。XJY+HCS+NVB组的G0/G1期细胞与XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB组比较，统计学分析具有差异(p<0.05)。XJY、HCS、NVB、XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB、XJY+HCS+NVB组的PCNA-LI均低于NS组(p<0.01)。XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB组的PCNA-LI均低于XJY、HCS、NVB(p<0.01)。XJY+HCS+NVB组的PCNA-LI低于XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB组(p<0.05)。结论 消积饮、华蟾素和长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌具有协同抑制肺癌细胞增殖作用，两药联合作用优于单药，三药联合作用优于单药及两药作用。其作用机理可能与协同作用于不同细胞周期有关。
关键词：中药；长春瑞滨；Lewis肺癌；细胞周期；细胞增殖抗原
中药可对肺癌细胞周期中不同时相的细胞具有杀伤作用，阻滞或延缓细胞周期中某一点或某一部分，从而导致细胞增殖的减慢或停止，达到杀灭肺癌细胞的目的，联合使用抗癌药物的原则为选择阻滞细胞周期不同时相的抗癌药物，以尽可能达到对细胞周期各时相都具有阻抑作用，最终达到最大限度的杀灭肿瘤细胞。新药长春瑞滨属于细胞周期特异性药物，可作用于肿瘤细胞G2期而抑制肿瘤生长。消积饮口服液是广东省名老中医刘伟胜教授所创建的中药方剂，实验表明[7]，消积饮可通过阻滞肺癌细胞周期的G0/G1期起到抗癌作用。华蟾素是中药蟾蜍皮制剂的抗肿瘤中成药，能够有效地阻止肿瘤细胞周期于S期。针对三药对肺癌细胞周期不同阻滞点作用的机制，在本实验中，我们使用三药抑制小鼠Lewis肺癌的生长，观察三药抗小鼠肺癌细胞增殖的作用，并对三药作用于肿瘤细胞不同周期的协同抗癌机制进行了研究。
一.材料与方法
1.1 动物及瘤株
清洁级C57BL/6小鼠90只，体重18g～22g、雄性、6～8周龄，由第一军医大学动物中心提供；Lewis肺癌瘤株由广州中医药大学肿瘤研究所提供。
1.2 药物与仪器
1.2.1 环磷酰胺：上海华联制药有限公司，0.1g/瓶，白色结晶体，批准文号：沪卫药准字(1995)，第012034号。
1.2.2 消积饮口服液：广州中医药大学第二附属医院院内制剂，主要成分：黄芪、补骨脂、云芝、大黄、白花蛇舌草、莪术、全蝎、蜈蚣等，10ml/支，含1.5g生药/ml，批号：20030224。
1.2.3 华蟾素：淮北生化制药厂，5ml/支，生药2mg/ml，淡黄色澄明液体，批准文号：ZZ-5029-皖药准字(2001)第Z003299号。
1.2.4 长春瑞滨：连云港豪森制药有限公司，1ml/支，10mg/ml，无色澄明液体，批准文号：国药准字X19990278。
1.2.5 流式细胞仪：Coulter Co.Ltd. EPS型流式细胞仪
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组及处理方法
全部实验采用无菌操作，取小鼠Lewis肺癌单细胞悬液，用生理盐水调制细胞悬液浓度至1×107/ml，每鼠右腋窝下接种0.2ml。接种次日将小鼠随机分成9组，按以下给药：NS阴性对照组：0.2 ml NS，I.P，qd×7d；CTX治疗组：CTX，30mg/kg体重，I.P，qd×7d；消积饮治疗组(XJY)：消积饮，0.2ml，P.O，qd×7d；华蟾素治疗组(HCS)：华蟾素，5ml/kg，I.P，qd×7d；长春瑞滨治疗组(NVB)：长春瑞滨，6.7mg/kg体重，I.P，qd×7d；其余四组XH、XN、HN与XHN组为相应的组合组，给予相应的联合药物。
1.3.2 计算瘤重及抑瘤率
停药次日使用颈椎脱臼法处死小鼠，完整剥离腋窝皮下肿瘤，去除血污、脂肪等，用电子天平称量体重及瘤重，根据以下公式计算抑瘤率：抑瘤率%＝(1-治疗组瘤重/阴性对照组瘤重)×100%。
1.3.3 细胞周期的观察
剥取部分新鲜肿瘤组织，PBS漂洗，浸泡，剪碎,混合，过滤，离心，再过滤，离心，75%的乙醇固定，Coulter-DNA-Prep Reagents Kit进行碘化丙啶(PI)染色，用EPS型流式细胞仪进行分析。
1.3.4 PCNA免疫组化
剥取部分新鲜肿瘤组织固定，脱水包埋，切片，脱腊后，梯度酒精水化，温浴，孵浴，DAB显色，脱水，封片。设PBS代替抗体作阴性对照及阳性对照片，显微镜下观察，细胞核呈棕黄色为阳性，每例随机观察几个视野(细胞总数大于2000)，计算PCNA阳性标记指数(PCNA-LI，%)，取平均值。
1.3.5 统计学分析
全部数据用均数±S表示，采用SPSS10.0统计软件进行数据分析，各组小鼠之间瘤重、细胞周期各时相分布采用单因素方差分析。
二.结果
2.1各组小鼠肿瘤生长情况(见图1)及各组肿瘤瘤重及抑瘤率(见表1)
消积饮(XJY)、华蟾素(HCS)、长春瑞滨(NVB)、消积饮联合华蟾素(XH)、消积饮联合长春瑞滨(XN)、华蟾素联合长春瑞滨(HN)、三药联合治疗组(XHN)的平均瘤重与生理盐水组相比有显著性差异(p<0.01)；抑瘤率分别为32.28%、44.44%、48.68%、51.32%、57.14%、58.73%、64.55%。两药联合组的平均瘤重与单药相比具有差异(p<0.05)；三药联合组的平均瘤重与单药、两药相比具有差异(p<0 ......
中药联合长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌细胞周期及细胞增殖抗原的影响
广州中医药大学第二临床医学院肿瘤科 吴万垠* 柴小姝 刘伟胜
摘 要： 目的 揭示中药消积饮、华蟾素联合长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌细胞周期的作用机制。方法 将90只皮下接种Lewis肺癌细胞的C57BL/6小鼠随机分成生理盐水阴性对照组(NS)、环磷酰胺治疗对照组(CTX)、消积饮组(XJY)、华蟾素组(HCS) 、长春瑞滨组(NVB)及其相应的组合(XH、XN、HN与XHN)，每组10只。给药7天后处死小鼠，比较各组小鼠的皮下瘤重，计算抑瘤率。运用FCM分析小鼠肿瘤细胞周期各时相分布的状况，并利用IHC计算PCNA阳性标记指数(PCNA-LI.%)。结果 各治疗组瘤重较NS组低(p<0.01)，抑瘤率分别是32.28%、44.44%、48.68%、51.32%、57.14%、58.73%、64.55%。XJY组的G0/G1期肿瘤细胞较生理盐水组比例增高(p<0.01)，HCS组的肿瘤细胞阻滞于S期，较生理盐水组比例增高(p<0.01)，NVB组的肿瘤细胞G2/M期细胞较生理盐水组比例增高(p<0.01)；XJY+HCS的肿瘤细胞G0/G1期、S期细胞比例较NS组均有所增高(p<0.01)，XJY+NVB的肿瘤细胞G0/G1期、G2/M期细胞比例较NS组均有所增高(p<0.01)，HCS+NVB的肿瘤细胞S期、G2/M期细胞比例较NS组略高(p>0.05)；XJY+HCS+NVB的肿瘤细胞G0/G1期细胞比例较其余所有组增高(p<0.01)。XJY+HCS+NVB组的G0/G1期细胞与XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB组比较，统计学分析具有差异(p<0.05)。XJY、HCS、NVB、XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB、XJY+HCS+NVB组的PCNA-LI均低于NS组(p<0.01)。XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB组的PCNA-LI均低于XJY、HCS、NVB(p<0.01)。XJY+HCS+NVB组的PCNA-LI低于XJY+HCS、XJY+NVB、HCS+NVB组(p<0.05)。结论 消积饮、华蟾素和长春瑞滨对小鼠Lewis肺癌具有协同抑制肺癌细胞增殖作用，两药联合作用优于单药，三药联合作用优于单药及两药作用。其作用机理可能与协同作用于不同细胞周期有关。
关键词：中药；长春瑞滨；Lewis肺癌；细胞周期；细胞增殖抗原
中药可对肺癌细胞周期中不同时相的细胞具有杀伤作用，阻滞或延缓细胞周期中某一点或某一部分，从而导致细胞增殖的减慢或停止，达到杀灭肺癌细胞的目的，联合使用抗癌药物的原则为选择阻滞细胞周期不同时相的抗癌药物，以尽可能达到对细胞周期各时相都具有阻抑作用，最终达到最大限度的杀灭肿瘤细胞。新药长春瑞滨属于细胞周期特异性药物，可作用于肿瘤细胞G2期而抑制肿瘤生长。消积饮口服液是广东省名老中医刘伟胜教授所创建的中药方剂，实验表明[7]，消积饮可通过阻滞肺癌细胞周期的G0/G1期起到抗癌作用。华蟾素是中药蟾蜍皮制剂的抗肿瘤中成药，能够有效地阻止肿瘤细胞周期于S期。针对三药对肺癌细胞周期不同阻滞点作用的机制，在本实验中，我们使用三药抑制小鼠Lewis肺癌的生长，观察三药抗小鼠肺癌细胞增殖的作用，并对三药作用于肿瘤细胞不同周期的协同抗癌机制进行了研究。
一.材料与方法
1.1 动物及瘤株
清洁级C57BL/6小鼠90只，体重18g～22g、雄性、6～8周龄，由第一军医大学动物中心提供；Lewis肺癌瘤株由广州中医药大学肿瘤研究所提供。
1.2 药物与仪器
1.2.1 环磷酰胺：上海华联制药有限公司，0.1g/瓶，白色结晶体，批准文号：沪卫药准字(1995)，第012034号。
1.2.2 消积饮口服液：广州中医药大学第二附属医院院内制剂，主要成分：黄芪、补骨脂、云芝、大黄、白花蛇舌草、莪术、全蝎、蜈蚣等，10ml/支，含1.5g生药/ml，批号：20030224。
1.2.3 华蟾素：淮北生化制药厂，5ml/支，生药2mg/ml，淡黄色澄明液体，批准文号：ZZ-5029-皖药准字(2001)第Z003299号。
1.2.4 长春瑞滨：连云港豪森制药有限公司，1ml/支，10mg/ml，无色澄明液体，批准文号：国药准字X19990278。
1.2.5 流式细胞仪：Coulter Co.Ltd. EPS型流式细胞仪
1.3 实验方法
1.3.1 动物分组及处理方法
全部实验采用无菌操作，取小鼠Lewis肺癌单细胞悬液，用生理盐水调制细胞悬液浓度至1×107/ml，每鼠右腋窝下接种0.2ml。接种次日将小鼠随机分成9组，按以下给药：NS阴性对照组：0.2 ml NS，I.P，qd×7d；CTX治疗组：CTX，30mg/kg体重，I.P，qd×7d；消积饮治疗组(XJY)：消积饮，0.2ml，P.O，qd×7d；华蟾素治疗组(HCS)：华蟾素，5ml/kg，I.P，qd×7d；长春瑞滨治疗组(NVB)：长春瑞滨，6.7mg/kg体重，I.P，qd×7d；其余四组XH、XN、HN与XHN组为相应的组合组，给予相应的联合药物。
1.3.2 计算瘤重及抑瘤率
停药次日使用颈椎脱臼法处死小鼠，完整剥离腋窝皮下肿瘤，去除血污、脂肪等，用电子天平称量体重及瘤重，根据以下公式计算抑瘤率：抑瘤率%＝(1-治疗组瘤重/阴性对照组瘤重)×100%。
1.3.3 细胞周期的观察
剥取部分新鲜肿瘤组织，PBS漂洗，浸泡，剪碎,混合，过滤，离心，再过滤，离心，75%的乙醇固定，Coulter-DNA-Prep Reagents Kit进行碘化丙啶(PI)染色，用EPS型流式细胞仪进行分析。
1.3.4 PCNA免疫组化
剥取部分新鲜肿瘤组织固定，脱水包埋，切片，脱腊后，梯度酒精水化，温浴，孵浴，DAB显色，脱水，封片。设PBS代替抗体作阴性对照及阳性对照片，显微镜下观察，细胞核呈棕黄色为阳性，每例随机观察几个视野(细胞总数大于2000)，计算PCNA阳性标记指数(PCNA-LI，%)，取平均值。
1.3.5 统计学分析
全部数据用均数±S表示，采用SPSS10.0统计软件进行数据分析，各组小鼠之间瘤重、细胞周期各时相分布采用单因素方差分析。
二.结果
2.1各组小鼠肿瘤生长情况(见图1)及各组肿瘤瘤重及抑瘤率(见表1)
消积饮(XJY)、华蟾素(HCS)、长春瑞滨(NVB)、消积饮联合华蟾素(XH)、消积饮联合长春瑞滨(XN)、华蟾素联合长春瑞滨(HN)、三药联合治疗组(XHN)的平均瘤重与生理盐水组相比有显著性差异(p<0.01)；抑瘤率分别为32.28%、44.44%、48.68%、51.32%、57.14%、58.73%、64.55%。两药联合组的平均瘤重与单药相比具有差异(p<0.05)；三药联合组的平均瘤重与单药、两药相比具有差异(p<0 ......
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