HPLC法测定感冒退热颗粒(冲剂)中连翘酯苷A的含量
作者：张炜 张汉明 郭美丽 杨继斌 朱美玲
单位：张 炜 张汉明 郭美丽 第二军医大学药学院(上海 200433)；杨继斌 朱美玲 上海市中药三厂
关键词：感冒退热冲剂；连翘酯苷A；HPLC
990413摘 要 以RP-HPLC测定了感冒退热冲剂中连翘酯苷A的含量；连翘酯苷A以冷浸超声法直接用甲醇提取；色谱条件为：ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇(含1%的四氢呋喃)-水(含0.01 mol/L磷酸二氢钾，pH 3.2)为流动相进行梯度洗脱；柱温室温；检测波长332 nm；实验表明本法简便、特异、准确，可用于本制剂的质量控制。
感冒退热冲剂为1997～1995版药典收载的中药成方制剂，具有清热、解毒等功效，临床用量很大。其组方为大青叶、板蓝根、连翘、拳参；药典除规定用薄层层析法定性鉴别板蓝根中的靛玉红成分外，尚未有合适的定量指标。由于靛玉红的极性较小，从感冒退热颗粒的生产工艺看，它已大部分被除去，不宜作为定量指标。考虑到连翘酯苷A为连翘的特征成分，且具有很强的抗菌[1]和抗病毒[2]活性，为此我们用RP-HPLC测定了感冒退热冲剂中连翘酯苷A的含量，获得了满意的分析结果，可为其质量控制提供参考。
, 百拇医药
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters公司M510和M590泵，490型UV/Vis检测器，740型色谱数据站，U6K进样阀，超声振荡器，pH计。
1.2 试剂与试药：甲醇、磷酸二氢钾、磷酸及四氢呋喃等均为分析纯，水为重蒸水。连翘酯苷A对照品由中国医学科学研究院提供，经光谱和HPLC法检测，纯度在95%以上。感冒退热冲剂由上海市中药三厂提供。
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(含1%四氢呋喃)-水(含0.01 mol/L 磷酸二氢钾，用磷酸调pH至3.2)[3]；流速1 mL/min；检测波长332 nm；灵敏度0.1AUFS；衰减32； 进样量10 μL，柱温室温，梯度洗脱条件见表1。
, 百拇医药
2.2 标准曲线的绘制：精密称取连翘酯苷A标准品5.0 mg，置10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，配成浓度为0.5 mg/mL的储备液，置冰箱保存。
取连翘酯苷A 储备液适量，用甲醇稀释成50、100、150、200、250、300、350、400 μg/mL的浓度，分别进样10 μL，将所测峰面积(X)与浓度(C)进行线性回归，得回归方程为：C=0.0376+3.428×10-6X，n=8,r=0.9996；标准品与样品色谱图见图1。
表1 流动相的梯度洗脱条件 时间(min)
甲醇(%)
水(%)
0
32
, http://www.100md.com
68
10
34
66
20
40
60
30
45
55
35
60
40
42
, 百拇医药
32
68
A-连翘酯苷A(峰a) B-样品 C-缺连翘的样品
图1 样品色谱图
2.3 稳定性试验：取同一样品试液，分别于2、4、6、8、12 h进样测定，得RSD=0.7%。取同一样品，均分成4份，分别于0、1、3、5、7 h进样测定，得RSD=4.4%。
2.4 精密度试验：取同一样品液，连续进样5 次，测得RSD=0.6%。
2.5 重复性试验：取同一批样品，均分成6份，按样品项下处理并测定含量，得RSD=97.88%。
, 百拇医药
2.6 回收率试验：取已知含量的样品，研细，均分成5份，每份1.5 g，分别加入含2 mg标准品溶液，按样品项下处理并测定含量，计算回收率，分别为99.42%、97.62、99.38%、98.96%、98.8%。
2.7 中成药样品的处理及含量测定：取样品一包，研细，精密称取3.5 g(含糖制剂6.0 g)，用30 mL甲醇冷浸过夜，超声振荡40 min，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，滤液浓缩至25 mL，即成供试液，备用。取10 μL进样，测定连翘酯苷A的含量，结果见表2，样品色谱图见图1。
表2 样品中连翘酯苷A的含量测定结果
样品批号
含量
mg/g
毫克/包
, http://www.100md.com
961104
0.925
4.164
961014
0.770
3.467
无糖型
970103
1.141
5.133
960107
1.081
4.865
, http://www.100md.com
970901
0.579
7.104
951102
0.587
10.573
含糖型
961002
0.303
5.460
970401
0.467
8.412
, http://www.100md.com
970901
0.441
7.938
3 讨论
3.1 感冒退热冲剂组方中的大青叶和板蓝根分别为十字花科植物菘蓝的叶和根，其主要化学成分为靛蓝和靛玉红；连翘为木犀科植物连翘的干燥果实，主要成分有苯乙醇苷类、木脂素及其苷类、五环三萜类和黄酮类等；拳参为蓼科植物拳参的干燥根茎，主含鞣质。药典规定以检测靛玉红为其质量控制指标，但在生产工艺的浓缩过程中其损失率可高达96.7%[4]，故不宜作为质控指标。根据近年来对连翘属植物的研究，发现其中的苯乙醇苷类成分连翘酯苷A具有很强的抗菌和抗病毒作用及广泛的生物学活性，极性较大且为连翘属植物的特征成分，故在进行连翘药材及其制剂感冒退热冲剂的质量控制时，以连翘酯苷A 作为主要指标是适宜的，也是可行的。
, 百拇医药
3.2 连翘酯苷A遇酸、碱或高温等不稳定，易引起分解；因此在提取过程中应尽量避免酸、碱或高温。实验表明，索氏提取法与冷浸超声法的提取效率相近，考虑到后者不但节约时间而且节省溶剂，故选用冷浸超声法提取。
3.3 由于制剂中有些成分化学性质相近，用恒比流动相无法分开，经摸索选用了梯度洗脱的方法。在本实验中，流动相的pH对连翘酯苷A分离效果影响很大，pH=3.0～3.5时可使连翘酯苷A得到良好峰形，如pH<2.5，尽管峰形变化不大，但柱效损失极快，故pH宜控制在3.0～3.5之间。
3.4 实验表明，含糖制剂的连翘酯苷A含量较无糖制剂的要高，可能与制备工艺不同有关；不同批号的样品之间含连翘酯苷A的量差别较大，究竟是原料来源不同还是生产操作中不够稳定所致，这些均有待进一步研究。
*Address:Zhang Wei, College of Pharmacy ,The Second Military University ,Shanghai
参 考 文 献
1 匡海学，等.中药通报，1988，13(7)：32
2 于起福，等.吉林中医药，1995，(1)：35
3 崔燕岩，等.药学学报，1992，27(8)：603
4 李 影，等.中成药，1990，12(9)：810
(1998-07-01收稿), http://www.100md.com
单位：张 炜 张汉明 郭美丽 第二军医大学药学院(上海 200433)；杨继斌 朱美玲 上海市中药三厂
关键词：感冒退热冲剂；连翘酯苷A；HPLC
990413摘 要 以RP-HPLC测定了感冒退热冲剂中连翘酯苷A的含量；连翘酯苷A以冷浸超声法直接用甲醇提取；色谱条件为：ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇(含1%的四氢呋喃)-水(含0.01 mol/L磷酸二氢钾，pH 3.2)为流动相进行梯度洗脱；柱温室温；检测波长332 nm；实验表明本法简便、特异、准确，可用于本制剂的质量控制。
感冒退热冲剂为1997～1995版药典收载的中药成方制剂，具有清热、解毒等功效，临床用量很大。其组方为大青叶、板蓝根、连翘、拳参；药典除规定用薄层层析法定性鉴别板蓝根中的靛玉红成分外，尚未有合适的定量指标。由于靛玉红的极性较小，从感冒退热颗粒的生产工艺看，它已大部分被除去，不宜作为定量指标。考虑到连翘酯苷A为连翘的特征成分，且具有很强的抗菌[1]和抗病毒[2]活性，为此我们用RP-HPLC测定了感冒退热冲剂中连翘酯苷A的含量，获得了满意的分析结果，可为其质量控制提供参考。
, 百拇医药
1 仪器与试药
1.1 仪器 Waters公司M510和M590泵，490型UV/Vis检测器，740型色谱数据站，U6K进样阀，超声振荡器，pH计。
1.2 试剂与试药：甲醇、磷酸二氢钾、磷酸及四氢呋喃等均为分析纯，水为重蒸水。连翘酯苷A对照品由中国医学科学研究院提供，经光谱和HPLC法检测，纯度在95%以上。感冒退热冲剂由上海市中药三厂提供。
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(含1%四氢呋喃)-水(含0.01 mol/L 磷酸二氢钾，用磷酸调pH至3.2)[3]；流速1 mL/min；检测波长332 nm；灵敏度0.1AUFS；衰减32； 进样量10 μL，柱温室温，梯度洗脱条件见表1。
, 百拇医药
2.2 标准曲线的绘制：精密称取连翘酯苷A标准品5.0 mg，置10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，配成浓度为0.5 mg/mL的储备液，置冰箱保存。
取连翘酯苷A 储备液适量，用甲醇稀释成50、100、150、200、250、300、350、400 μg/mL的浓度，分别进样10 μL，将所测峰面积(X)与浓度(C)进行线性回归，得回归方程为：C=0.0376+3.428×10-6X，n=8,r=0.9996；标准品与样品色谱图见图1。
表1 流动相的梯度洗脱条件 时间(min)
甲醇(%)
水(%)
0
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68
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A-连翘酯苷A(峰a) B-样品 C-缺连翘的样品
图1 样品色谱图
2.3 稳定性试验：取同一样品试液，分别于2、4、6、8、12 h进样测定，得RSD=0.7%。取同一样品，均分成4份，分别于0、1、3、5、7 h进样测定，得RSD=4.4%。
2.4 精密度试验：取同一样品液，连续进样5 次，测得RSD=0.6%。
2.5 重复性试验：取同一批样品，均分成6份，按样品项下处理并测定含量，得RSD=97.88%。
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2.6 回收率试验：取已知含量的样品，研细，均分成5份，每份1.5 g，分别加入含2 mg标准品溶液，按样品项下处理并测定含量，计算回收率，分别为99.42%、97.62、99.38%、98.96%、98.8%。
2.7 中成药样品的处理及含量测定：取样品一包，研细，精密称取3.5 g(含糖制剂6.0 g)，用30 mL甲醇冷浸过夜，超声振荡40 min，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，滤液浓缩至25 mL，即成供试液，备用。取10 μL进样，测定连翘酯苷A的含量，结果见表2，样品色谱图见图1。
表2 样品中连翘酯苷A的含量测定结果
样品批号
含量
mg/g
毫克/包
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961104
0.925
4.164
961014
0.770
3.467
无糖型
970103
1.141
5.133
960107
1.081
4.865
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970901
0.579
7.104
951102
0.587
10.573
含糖型
961002
0.303
5.460
970401
0.467
8.412
, http://www.100md.com
970901
0.441
7.938
3 讨论
3.1 感冒退热冲剂组方中的大青叶和板蓝根分别为十字花科植物菘蓝的叶和根，其主要化学成分为靛蓝和靛玉红；连翘为木犀科植物连翘的干燥果实，主要成分有苯乙醇苷类、木脂素及其苷类、五环三萜类和黄酮类等；拳参为蓼科植物拳参的干燥根茎，主含鞣质。药典规定以检测靛玉红为其质量控制指标，但在生产工艺的浓缩过程中其损失率可高达96.7%[4]，故不宜作为质控指标。根据近年来对连翘属植物的研究，发现其中的苯乙醇苷类成分连翘酯苷A具有很强的抗菌和抗病毒作用及广泛的生物学活性，极性较大且为连翘属植物的特征成分，故在进行连翘药材及其制剂感冒退热冲剂的质量控制时，以连翘酯苷A 作为主要指标是适宜的，也是可行的。
, 百拇医药
3.2 连翘酯苷A遇酸、碱或高温等不稳定，易引起分解；因此在提取过程中应尽量避免酸、碱或高温。实验表明，索氏提取法与冷浸超声法的提取效率相近，考虑到后者不但节约时间而且节省溶剂，故选用冷浸超声法提取。
3.3 由于制剂中有些成分化学性质相近，用恒比流动相无法分开，经摸索选用了梯度洗脱的方法。在本实验中，流动相的pH对连翘酯苷A分离效果影响很大，pH=3.0～3.5时可使连翘酯苷A得到良好峰形，如pH<2.5，尽管峰形变化不大，但柱效损失极快，故pH宜控制在3.0～3.5之间。
3.4 实验表明，含糖制剂的连翘酯苷A含量较无糖制剂的要高，可能与制备工艺不同有关；不同批号的样品之间含连翘酯苷A的量差别较大，究竟是原料来源不同还是生产操作中不够稳定所致，这些均有待进一步研究。
*Address:Zhang Wei, College of Pharmacy ,The Second Military University ,Shanghai
参 考 文 献
1 匡海学，等.中药通报，1988，13(7)：32
2 于起福，等.吉林中医药，1995，(1)：35
3 崔燕岩，等.药学学报，1992，27(8)：603
4 李 影，等.中成药，1990，12(9)：810
(1998-07-01收稿), http://www.100md.com