叶下珠复方肝丹体外抗HBV作用特点的实验研究
作者：王 岭 张均倡 罗上武 万金志 张 云
单位：王 岭 张均倡 罗上武 万金志 张 云(广州中医药大学附属珠海市中医院 珠海 519015)
关键词：肝丹；叶下珠；中药复方；抗病毒药
摘 要 目的 探讨叶下珠复方肝丹对HBV的体外作用特点 摘 要 目的 探讨叶下珠复方肝丹对HBV的体外作用特点。方法 通过2.2.15细胞系模型的改进实验方法，连续每天测定相关数据，动态观察药物对HBV的作用情况。结果 有如下特征：①有1个药物作用曲线，即从开始用药到见到效果有个过程，需4d～5d，较强的抑制HBV作用可维持3d～4d，然后逐渐减弱、 消失；②在HBV分泌、复制旺盛的时期，药物对HBV的抑制作用表现得越强，越能显示出药物的作用；③药物的作用具有呈正比的量效关系。结论 体外实验证实肝丹具有抗HBV的作用。
为了观察叶下珠复方肝丹体外抑制HBV的作用及其特点，我们根据临床上每天给药动态维持药物有效浓度的用药特点，对2.2.15细胞模型的实验方法进行了改进，以此进行实验，现将有关研究情况报道如下：
, 百拇医药
材料与方法
1 药物 肝丹由广州中医药大学附属珠海市中医院生产，以叶下珠为主药，配伍柴胡、白芍、五味子、茵陈、溪黄草、夏枯草、党参、薏苡仁、鸡内金、露蜂房、蜈蚣等组成，批准文号：粤珠卫药制剂[1996]B001，生产批号：970803。阳性对照药乙肝宁冲剂由长沙九芝堂制药厂生产，批准文号：湘卫药准字[92]02—151号，生产批号：960302。
2 药物处理 分别取肝丹丸剂粉碎后过筛所得细粉及乙肝宁冲剂颗粒20g，加10倍蒸馏水文火煎煮10min取煎汁，药渣加蒸馏水再煎2次，合并3次煎汁，用滤纸过滤，水浴蒸发至100%溶液；10磅10min无菌处理后分装小管，4℃保存备用。
3 2.2.15细胞 引自北京302医院病毒室。该肝癌细胞系为含有乙型肝炎病毒(HBV)基因的多倍体，能转录、翻译HBV基因并产生HBV表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)、HBV-DNA和HBV颗粒。
, 百拇医药
4 主要试剂与仪器
4.1 试剂 DMEM(Gibco),G418(Sigma)，谷氨酰胺(Sigma)，新生小牛血清(广州市畜牧场)，HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂盒(上海科华)，HBV-DNA PCR检测试剂盒(河南华美)，余为分析纯试剂。
4.2 仪器CO2培养箱(日本)，PCR扩增仪(1169型、北京)，紫外分光光度计(754-G、上海)，倒置显微镜(德国)，紫外透射反射仪(上海)，酶标检测仪(南京)，电泳仪(北京)，细胞培养板(Gibco)。
5 实验方法
5.1 2.2.15细胞的培养 DMEM中加入380mg/L G418，15%新生小牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，1%青、链霉素，4.4%NaHCO3调pH至7.2～7.4，37℃5%CO2培养，每10d传代1次。
, 百拇医药
5.2 药物对细胞的毒性作用试验 将2.2.15细胞按1×104/ml接种96孔细胞培养板，每孔0.2ml，次日用培养液将各种药物作系列2倍稀释(1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600)加入细胞孔，每稀释度5孔，每4d换相同浓度的相同药液，设不加药物细胞对照，观察记录结果。毒性判断标准为：不加药物细胞无自然蜕变，加药物孔细胞被破坏75%～100%为++++,50%～74%为+++，25%～49%为++，1%～24%为+，高倍镜(400倍)下无明显可观察细胞破坏为\|。按Reed-Meuench法计算药物对细胞生长的半数毒性浓度(TC50)。
5.3 HBsAg、HBeAg分泌规律和HBV-DNA复制试验 将2.2.15细胞按2×105/ml接种24孔细胞培养板，每孔1.2ml，共10孔，每天收集培养上清250μl，培养液补足原量至第13d，培养上清-30℃冻存，最后1次按试剂盒说明书ELISA法测定HBsAg、HBeAg；PCR法检测HBV-DNA。
, http://www.100md.com
5.4 药物对HBsAg、HBeAg表达和HBV-DNA复制的抑制试验 将2.2.15细胞按2×105/ml接种24孔细胞培养板，每孔1.2ml，次日弃培养液。以不同药物对2.2.15细胞的最大无毒剂量为起始浓度，加入培养液稀释(系列2倍稀释)的不同浓度的不同药物，每浓度6孔，同时设不加药物对照，以后每天每孔取培养上清250μl，-30℃冻存，集中用ELISA法测定HBsAg、HBeAg，400nm测定OD值；并计算药物对抗原的抑制率、半数有效浓度(IC50)和治疗指数(TI)判断药物效果。用PCR法测定HVB-DNA。
①药物对HBsAg、HBeAg分泌的抑制率由下列公式计算：
②药物对抗原的半数有效浓度(IC50)：按Reed-Meuench法计算；
, 百拇医药
③治疗指数(TI)=TC50/IC50
以上实验均重复1次。
结果
1 药物对2.2.15细胞的毒性作用 肝丹、乙肝宁冲剂对2.2.15细胞的最大无毒剂量分别为2.5mg/ml、2.0mg/ml；对2.2.15细胞的TC50分别为(3.75±0.98)mg/ml和(2.98±0.74)mg/ml。
2 2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg分泌规律 2.2.15细胞培养至第2d或第3d，开始有HBsAg、HBeAg分泌，以后逐渐增加，于第7d达到高峰，然后逐渐减弱，持续到第13d。所测平均OD值，见表1。
表1 2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg分泌规律(OD值)
, 百拇医药
时间(d)
阴性
对照
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
, 百拇医药
12
13
HBsAg
0.06
0.09
0.15
0.21
0.25
0.36
0.38
0.34
0.29
0.23
, 百拇医药
0.14
0.12
0.10
0.04
HBeAg
0.06
0.06
0.10
0.16
0.20
0.28
0.20
0.22
, 百拇医药
0.14
0.14
0.14
0.10
0.10
0.05
表2 不同药物对2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用
时间
(d)
肝丹(mg/ml)
乙肝宁冲剂(mg/ml)
2.2.15
, 百拇医药
细胞
对照
阴性
对照
2.0
1.0
0.5
0.25
2.0
1.0
0.5
0.25
OD抑制
, http://www.100md.com
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
, http://www.100md.com
OD抑制
值率(%)
1
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
, 百拇医药
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.02
2
0.06
0.0
0.06
0.0
, 百拇医药
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
, 百拇医药
3
0.07
61.53
0.08
53.85
0.08
53.85
0.09
46.15
0.12
23.08
0.13
15.38
, 百拇医药
0.13
15.38
0.14
7.96
0.15
0.02
4
0.08
68-42
0.08
68.42
0.11
52.63
, 百拇医药
0.18
15.78
0.17
21.05
0.18
15.78
0.18
15.78
0.18
15.78
0.21
5
0.08
, http://www.100md.com
73.91
0.08
73.91
0.10
65.21
0.17
34.78
0.17
34.78
0.17
34.78
0.19
26.08
, http://www.100md.com
0.28
30.43
0.25
6
0.10
81.25
0.10
81.25
0.15
65.63
0.22
43.75
0.20
, 百拇医药
50.00
0.23
40.63
0.23
40.63
0.25
34.38
0.36
0.04
7
0.12
76.47
0.12
, http://www.100md.com
76.47
0.14
70.59
0.25
38.24
0.20
52.49
0.22
47.06
0.23
44.12
0.27
32.35
, 百拇医药
0.38
8
0.10
80.00
0.11
76.67
0.15
63.33
0.27
23.20
0.22
40.00
0.22
, 百拇医药
40.00
0.22
10.00
0.26
26.67
0.34
9
0.13
64.00
0.16
52.00
0.17
48.00
, 百拇医药
0.27
8.00
0.23
24.00
0.24
20.00
0.24
20.00
0.26
12.00
0.29
10
0.15
, http://www.100md.com
42.11
0.17
31.58
0.20
15.79
0.22
5.27
0.22
5.27
0.23
0.0
0.23
0.0
, http://www.100md.com
0.23
0.0
0.23
11
0.18
30.00
0.22
10.0
0.22
10.0
0.23
5.00
0.23
, 百拇医药
5.00
0.24
0.0
0.24
0.0
0.24
0.0
0.24
12
0.11
30.00
0.13
10.0
, http://www.100md.com
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
, http://www.100md.com
13
0.10
12.50
0.12
0.0
0.12
0.0
0.12
0.0
0.12
0.0
0.12
0.0
, 百拇医药
0.12
0.0
0.10
0.0
0.10
表3 不同药物对2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用
时间
(d)
肝丹(mg/ml)
乙肝宁冲剂(mg/ml)
2.2.15
, http://www.100md.com
细胞
对照
阴性
对照
2.0
1.0
0.5
0.25
2.0
1.0
0.5
0.25
OD抑制
, 百拇医药
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
, 百拇医药
OD抑制
值率(%)
1
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
, 百拇医药
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.05
2
0.07
60.00
0.07
60.00
, 百拇医药
0.07
60.00
0.08
40.00
0.09
20.00
0.09
20.00
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
, 百拇医药
3
0.09
63.63
0.09
63.63
0.09
63.63
0.11
45.45
0.11
45.45
0.13
27.27
, 百拇医药
0.13
27.27
0.14
18.18
0.16
4
0.11
60.07
0.11
60.07
0.12
53.33
0.14
, 百拇医药
40.07
0.14
40.00
0.14
40.00
0.15
33.33
0.16
26.67
0.20
5
0.11
71.43
, 百拇医药
0.11
71.43
0.13
61.90
0.13
61.90
0.17
42.86
0.18
39.10
0.19
33.30
0.20
, http://www.100md.com
28.57
0.26
6
0.11
73.91
0.12
69.57
0.12
69.57
0.13
65.22
0.17
47.83
, http://www.100md.com
0.17
47.83
0.19
39.13
0.19
39.13
0.28
0.05
7
0.13
63.67
0.13
63.67
, 百拇医药
0.14
59.10
0.15
54.55
0.18
40.90
0.18
40.90
0.20
31.82
0.21
27.27
0.27
, 百拇医药
8
0.13
57.89
0.12
41.15
0.14
52.63
0.14
52.63
0.17
36.84
0.18
31.58
, http://www.100md.com
0.18
31.58
0.20
31.05
0.24
9
0.12
46.15
0.14
30.80
0.14
30.80
0.14
, http://www.100md.com
30.80
0.16
15.38
0.17
7.69
0.17
7.69
0.17
7.69
0.18
10
0.12
22.22
, 百拇医药
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
, 百拇医药
0.0
0.14
11
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
, 百拇医药
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
12
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
, 百拇医药
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
13
, 百拇医药
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
, http://www.100md.com
0.0
0.10
0.0
0.10
表4 不同药物抑制2.2.15细胞分泌HBsAg的治疗指数
时间
(d)
肝丹
乙肝宁
TC50(mg/ml)
IC50(mg/ml)
TI
, http://www.100md.com
TC50(mg/ml)
IC50(mg/ml)
TI
5
3.75±0.25
0.67±0.19
5.60±0.05
2.98±0.24
1.53±0.15
1.95±0.02
6
3.75±0.25
, 百拇医药
0.61±0.17
6.15±0.07
2.98±0.24
1.49±0.32
2.00±0.05
7
3.75±0.25
0.48±0.26
7.81±0.04
2.98±0.24
1.24±0.28
2.40±0.05
, 百拇医药
8
3.75±0.25
0.53±0.14
7.08±0.03
2.98±0.24
1.36±0.17
2.19±0.04
表5 不同药物抑制2.2.15细胞分泌HBeAg的治疗指数
时间
(d)
肝丹
乙肝宁
, 百拇医药
TC50(mg/ml)
IC50(mg/ml)
TI
TC50(mg/ml)
IC50(mg/ml)
TI
5
3.75±0.25
0.47±0.23
7.98±0.03
2.98±0.24
, 百拇医药
0.92±0.14
3.24±0.04
6
3.75±0.25
0.35±0.12
10.71±0.04
2.98±0.24
0.85±0.27
3.51±0.09
3 2.2.15细胞的HBA-DNA复制规律 结果表明，2.2.15细胞培养第1d即可从培养上清中检出HBV-DNA，并可持续至第13d,其中以第5d～8dDNA条带荧光强度最强，表示其DNA含量最高，其复制规律与HBsAg、HBeAg分泌规律相似。
, 百拇医药
4 不同药物对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用 结果见表2、表3；作用较强时期的IC50及TI见表4、表5。
5 不同药物对HBV-DNA复制的抑制作用 以当天不加药物2.2.15细胞上清经PCR扩增DNA条带荧光强度为++++，较之有减弱为++，不出现条带为-。不同药物对HBV-DNA复制的抑制作用结果见表6。 讨论
近几年，国内外不少学者对叶下珠抗HBV的作用进行了多方面的研究，反映不一，但也确取得了一些成绩[1，2]；近来国外有学者利用体外细胞模型进一步阐述了叶下珠抗HBV的机制，并证实了能降低HBV复制过程中HBsAg mRNA的水平[3，4]。
表6 不同药物对2.2.15细胞HBV-DNA复制的抑制作用
时间
, http://www.100md.com
(d)
肝丹(mg/ml)
乙肝宁冲剂(mg/ml)
2.2.15
细胞
对照
阴性
血清
对照
2.0
1.0
0.5
0.25
, http://www.100md.com
2.0
1.0
0.5
0.25
1
++++
++++
++++
++++
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++++
++++
++++
, 百拇医药
++++
-
2
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++++
++++
++++
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-
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3
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++
++++
++++
++++
++++
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++++
-
4
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, 百拇医药
++
++++
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++
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++++
-
5
++
++
++
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++
++
++
++++
++++
-
6
-
-
++
++++
++
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, 百拇医药
++
++++
++++
-
7
-
-
++
++++
-
++
++
++++
++++
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-
8
++
++
++
++++
++
++
++++
++++
++++
-
9
++
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++
++
++++
++
++++
++++
++++
++++
-
10
++
++
++++
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++++
++++
++++
++++
++++
++++
-
11
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++++
++++
++++
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++++
-
12
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13
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++++
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为了动态观察临床应用效果良好的叶下珠复方肝康对HBV的作用情况，本项实验在细胞培养更换培养液方面与以往方法[2]有所不同，对体外抗HBV实验模型2.2.15细胞株的培养方式进行了改进，率先将细胞培养液的更换由每4d全部更换1次改为每天更换1/5，并每天对更换下来的培养液进行检测，连续动态观察13d，得到检测指标的动态曲线。这样的优点在于：一方面可以在实验期间动态保持培养液及药物浓度的一致性，又能符合临床上每天给药动态维持药物有效浓度的用药特点，另一方面每天更换下来用于检测的培养液不仅能反映HBV的复制或药物的抑制作用，而且所处条件一致具有很好的可比性，有利于从细胞生理、细胞凋亡等多个角度来分析问题。分析结果可以看出有如下特征：①均存在一个相似的药物作用曲线，即从开始用药到见到效果有个过程，需3d～4d，较强的抑制HBV作用可维持3d～5d，然后逐渐减弱、消失；②对照本实验方法的HBV分泌与复制规律可以看出，在HBV分泌、复制越是旺盛的时期，药物对HBV的抑制作用表现得越强，越能显示出药物的作用；③药物的作用具有呈正比的量效关系，即药效强弱与剂量大小有一定的依赖关系；由此可以说明肝康具有抗HBV的作用。
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从药物对HBsAg、HBeAg及HBV-DNA的影响来看，三者均有类似的作用曲线，看来它们存在着类似的作用规律，其内在的联系尚待进一步研究。
从本实验的药物作用曲线看，如何维持药物作用是个值得关注的问题，尚需从多方面进一步探讨，如：呈量效依赖关系时，每天药液更换量可否加大；细胞培养的实验设计作适当修改等等。
另外，从临床应用情况看，肝康对慢乙肝HBV复制指标(HBeAg、HBV-DNA)阳性的患者，具有促复制指标阴转的作用，能反映出其抗病毒效果，而对复制指标阴性者，除复制指标外其他变化不明显(即HBsAg阴转率不高)，这种HBV复制越明显越能反映抗HBV作用的临床疗效特征，看来与本实验的HBV分泌、复制越强，抗HBV的作用越明显的药物作用特点有一定关系。此外，干扰素在慢乙肝的临床应用中亦有类似的临床疗效特征，有关机制值得进一步多方探讨。
关于叶下珠体外抗HBV作用机制，有学者用2.2.15细胞模型对不同品种、剂型和添加剂成分的叶下珠提取物进行实验，发现药物对病毒颗粒产生的抑制不仅在转录前水平，可能对mRNA的翻译水平也有影响[5]。有学者提出中药体外抑制HBV的作用机理可能是作用于病毒的转录、翻译和蛋白合成等环节或直接与病毒蛋白结合而致HBsAg、HBeAg滴度下降[6]，那么肝丹是否如此尚需进一步研究。
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本项实验研究人体外抗HBV方面证实了：叶下珠复方“肝丹”具有抗HBV的作用。值得进一步研究与开发。
作者简介：王岭，女，38岁，主治医师，现就职于广州中医药大学附属珠海市中医院肝病科，从事肝病的临床与科研工作。参加了国家“八五”攻关项目及广东省中医药管理局课题的研究工作，主编了《中西医结合传染病学》等多本专著。
参考文献
1 王灵台，何燕，任家潍，等.苦味叶下珠抗乙肝病毒的临床研究.中西医结合肝病，1992，2(2)：6
2 陈征途，李凤仙，邓文娣，等.不同品种、不同产地叶下珠属植物在体外细胞培养中抗HBV作用的研究.中草药，1997，28(10)：616
3 Jayaram S,Thyagarajan SP. Inhaibition of HbsAg secretion from Alexander cell line by Phyllanthus amarus. Indian-J-Pathol-Microbiol, 1996, Jul; 39(3):211
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4 Lee CD, Ott M, Thyagarajan-SP, et al. Phyllanthus amarus down-regulates hepatitis B virus mRNA transcription and replication. Eur-J-Clin-Invest, 1996,Dec;26(12):1069
5 刘庄，傅希贤，张乃临，等.中草药叶下珠不同品种和制剂体外抗乙型肝炎病毒的实验研究.中华实验和临床病毒学杂志，1997，11(3)：282
6.范涛，傅希贤，张国庆，等.中草药抗乙型肝炎病毒活性及其作用机理体外实验研究.中 华实验和临床病毒学杂志，1996，10(1)：27
致谢：贵阳医学院李淑芳、左丽等老师为本实验研究做了大量工作，特致以谢忱!
(收稿日期 1999—02—03 修回日期 1999—04—10), 百拇医药
单位：王 岭 张均倡 罗上武 万金志 张 云(广州中医药大学附属珠海市中医院 珠海 519015)
关键词：肝丹；叶下珠；中药复方；抗病毒药
摘 要 目的 探讨叶下珠复方肝丹对HBV的体外作用特点 摘 要 目的 探讨叶下珠复方肝丹对HBV的体外作用特点。方法 通过2.2.15细胞系模型的改进实验方法，连续每天测定相关数据，动态观察药物对HBV的作用情况。结果 有如下特征：①有1个药物作用曲线，即从开始用药到见到效果有个过程，需4d～5d，较强的抑制HBV作用可维持3d～4d，然后逐渐减弱、 消失；②在HBV分泌、复制旺盛的时期，药物对HBV的抑制作用表现得越强，越能显示出药物的作用；③药物的作用具有呈正比的量效关系。结论 体外实验证实肝丹具有抗HBV的作用。
为了观察叶下珠复方肝丹体外抑制HBV的作用及其特点，我们根据临床上每天给药动态维持药物有效浓度的用药特点，对2.2.15细胞模型的实验方法进行了改进，以此进行实验，现将有关研究情况报道如下：
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材料与方法
1 药物 肝丹由广州中医药大学附属珠海市中医院生产，以叶下珠为主药，配伍柴胡、白芍、五味子、茵陈、溪黄草、夏枯草、党参、薏苡仁、鸡内金、露蜂房、蜈蚣等组成，批准文号：粤珠卫药制剂[1996]B001，生产批号：970803。阳性对照药乙肝宁冲剂由长沙九芝堂制药厂生产，批准文号：湘卫药准字[92]02—151号，生产批号：960302。
2 药物处理 分别取肝丹丸剂粉碎后过筛所得细粉及乙肝宁冲剂颗粒20g，加10倍蒸馏水文火煎煮10min取煎汁，药渣加蒸馏水再煎2次，合并3次煎汁，用滤纸过滤，水浴蒸发至100%溶液；10磅10min无菌处理后分装小管，4℃保存备用。
3 2.2.15细胞 引自北京302医院病毒室。该肝癌细胞系为含有乙型肝炎病毒(HBV)基因的多倍体，能转录、翻译HBV基因并产生HBV表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)、HBV-DNA和HBV颗粒。
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4 主要试剂与仪器
4.1 试剂 DMEM(Gibco),G418(Sigma)，谷氨酰胺(Sigma)，新生小牛血清(广州市畜牧场)，HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂盒(上海科华)，HBV-DNA PCR检测试剂盒(河南华美)，余为分析纯试剂。
4.2 仪器CO2培养箱(日本)，PCR扩增仪(1169型、北京)，紫外分光光度计(754-G、上海)，倒置显微镜(德国)，紫外透射反射仪(上海)，酶标检测仪(南京)，电泳仪(北京)，细胞培养板(Gibco)。
5 实验方法
5.1 2.2.15细胞的培养 DMEM中加入380mg/L G418，15%新生小牛血清，2mmol/L谷氨酰胺，1%青、链霉素，4.4%NaHCO3调pH至7.2～7.4，37℃5%CO2培养，每10d传代1次。
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5.2 药物对细胞的毒性作用试验 将2.2.15细胞按1×104/ml接种96孔细胞培养板，每孔0.2ml，次日用培养液将各种药物作系列2倍稀释(1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600)加入细胞孔，每稀释度5孔，每4d换相同浓度的相同药液，设不加药物细胞对照，观察记录结果。毒性判断标准为：不加药物细胞无自然蜕变，加药物孔细胞被破坏75%～100%为++++,50%～74%为+++，25%～49%为++，1%～24%为+，高倍镜(400倍)下无明显可观察细胞破坏为\|。按Reed-Meuench法计算药物对细胞生长的半数毒性浓度(TC50)。
5.3 HBsAg、HBeAg分泌规律和HBV-DNA复制试验 将2.2.15细胞按2×105/ml接种24孔细胞培养板，每孔1.2ml，共10孔，每天收集培养上清250μl，培养液补足原量至第13d，培养上清-30℃冻存，最后1次按试剂盒说明书ELISA法测定HBsAg、HBeAg；PCR法检测HBV-DNA。
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5.4 药物对HBsAg、HBeAg表达和HBV-DNA复制的抑制试验 将2.2.15细胞按2×105/ml接种24孔细胞培养板，每孔1.2ml，次日弃培养液。以不同药物对2.2.15细胞的最大无毒剂量为起始浓度，加入培养液稀释(系列2倍稀释)的不同浓度的不同药物，每浓度6孔，同时设不加药物对照，以后每天每孔取培养上清250μl，-30℃冻存，集中用ELISA法测定HBsAg、HBeAg，400nm测定OD值；并计算药物对抗原的抑制率、半数有效浓度(IC50)和治疗指数(TI)判断药物效果。用PCR法测定HVB-DNA。
①药物对HBsAg、HBeAg分泌的抑制率由下列公式计算：
②药物对抗原的半数有效浓度(IC50)：按Reed-Meuench法计算；
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③治疗指数(TI)=TC50/IC50
以上实验均重复1次。
结果
1 药物对2.2.15细胞的毒性作用 肝丹、乙肝宁冲剂对2.2.15细胞的最大无毒剂量分别为2.5mg/ml、2.0mg/ml；对2.2.15细胞的TC50分别为(3.75±0.98)mg/ml和(2.98±0.74)mg/ml。
2 2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg分泌规律 2.2.15细胞培养至第2d或第3d，开始有HBsAg、HBeAg分泌，以后逐渐增加，于第7d达到高峰，然后逐渐减弱，持续到第13d。所测平均OD值，见表1。
表1 2.2.15细胞的HBsAg、HBeAg分泌规律(OD值)
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时间(d)
阴性
对照
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
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12
13
HBsAg
0.06
0.09
0.15
0.21
0.25
0.36
0.38
0.34
0.29
0.23
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0.14
0.12
0.10
0.04
HBeAg
0.06
0.06
0.10
0.16
0.20
0.28
0.20
0.22
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0.14
0.14
0.14
0.10
0.10
0.05
表2 不同药物对2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用
时间
(d)
肝丹(mg/ml)
乙肝宁冲剂(mg/ml)
2.2.15
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细胞
对照
阴性
对照
2.0
1.0
0.5
0.25
2.0
1.0
0.5
0.25
OD抑制
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值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
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OD抑制
值率(%)
1
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
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0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.02
2
0.06
0.0
0.06
0.0
, 百拇医药
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
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3
0.07
61.53
0.08
53.85
0.08
53.85
0.09
46.15
0.12
23.08
0.13
15.38
, 百拇医药
0.13
15.38
0.14
7.96
0.15
0.02
4
0.08
68-42
0.08
68.42
0.11
52.63
, 百拇医药
0.18
15.78
0.17
21.05
0.18
15.78
0.18
15.78
0.18
15.78
0.21
5
0.08
, http://www.100md.com
73.91
0.08
73.91
0.10
65.21
0.17
34.78
0.17
34.78
0.17
34.78
0.19
26.08
, http://www.100md.com
0.28
30.43
0.25
6
0.10
81.25
0.10
81.25
0.15
65.63
0.22
43.75
0.20
, 百拇医药
50.00
0.23
40.63
0.23
40.63
0.25
34.38
0.36
0.04
7
0.12
76.47
0.12
, http://www.100md.com
76.47
0.14
70.59
0.25
38.24
0.20
52.49
0.22
47.06
0.23
44.12
0.27
32.35
, 百拇医药
0.38
8
0.10
80.00
0.11
76.67
0.15
63.33
0.27
23.20
0.22
40.00
0.22
, 百拇医药
40.00
0.22
10.00
0.26
26.67
0.34
9
0.13
64.00
0.16
52.00
0.17
48.00
, 百拇医药
0.27
8.00
0.23
24.00
0.24
20.00
0.24
20.00
0.26
12.00
0.29
10
0.15
, http://www.100md.com
42.11
0.17
31.58
0.20
15.79
0.22
5.27
0.22
5.27
0.23
0.0
0.23
0.0
, http://www.100md.com
0.23
0.0
0.23
11
0.18
30.00
0.22
10.0
0.22
10.0
0.23
5.00
0.23
, 百拇医药
5.00
0.24
0.0
0.24
0.0
0.24
0.0
0.24
12
0.11
30.00
0.13
10.0
, http://www.100md.com
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
, http://www.100md.com
13
0.10
12.50
0.12
0.0
0.12
0.0
0.12
0.0
0.12
0.0
0.12
0.0
, 百拇医药
0.12
0.0
0.10
0.0
0.10
表3 不同药物对2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制作用
时间
(d)
肝丹(mg/ml)
乙肝宁冲剂(mg/ml)
2.2.15
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细胞
对照
阴性
对照
2.0
1.0
0.5
0.25
2.0
1.0
0.5
0.25
OD抑制
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值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
OD抑制
值率(%)
, 百拇医药
OD抑制
值率(%)
1
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
, 百拇医药
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.0
0.06
0.05
2
0.07
60.00
0.07
60.00
, 百拇医药
0.07
60.00
0.08
40.00
0.09
20.00
0.09
20.00
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
, 百拇医药
3
0.09
63.63
0.09
63.63
0.09
63.63
0.11
45.45
0.11
45.45
0.13
27.27
, 百拇医药
0.13
27.27
0.14
18.18
0.16
4
0.11
60.07
0.11
60.07
0.12
53.33
0.14
, 百拇医药
40.07
0.14
40.00
0.14
40.00
0.15
33.33
0.16
26.67
0.20
5
0.11
71.43
, 百拇医药
0.11
71.43
0.13
61.90
0.13
61.90
0.17
42.86
0.18
39.10
0.19
33.30
0.20
, http://www.100md.com
28.57
0.26
6
0.11
73.91
0.12
69.57
0.12
69.57
0.13
65.22
0.17
47.83
, http://www.100md.com
0.17
47.83
0.19
39.13
0.19
39.13
0.28
0.05
7
0.13
63.67
0.13
63.67
, 百拇医药
0.14
59.10
0.15
54.55
0.18
40.90
0.18
40.90
0.20
31.82
0.21
27.27
0.27
, 百拇医药
8
0.13
57.89
0.12
41.15
0.14
52.63
0.14
52.63
0.17
36.84
0.18
31.58
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0.18
31.58
0.20
31.05
0.24
9
0.12
46.15
0.14
30.80
0.14
30.80
0.14
, http://www.100md.com
30.80
0.16
15.38
0.17
7.69
0.17
7.69
0.17
7.69
0.18
10
0.12
22.22
, 百拇医药
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
, 百拇医药
0.0
0.14
11
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
, 百拇医药
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
0.0
0.14
12
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
, 百拇医药
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
13
, 百拇医药
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
0.0
0.10
, http://www.100md.com
0.0
0.10
0.0
0.10
表4 不同药物抑制2.2.15细胞分泌HBsAg的治疗指数
时间
(d)
肝丹
乙肝宁
TC50(mg/ml)
IC50(mg/ml)
TI
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TC50(mg/ml)
IC50(mg/ml)
TI
5
3.75±0.25
0.67±0.19
5.60±0.05
2.98±0.24
1.53±0.15
1.95±0.02
6
3.75±0.25
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0.61±0.17
6.15±0.07
2.98±0.24
1.49±0.32
2.00±0.05
7
3.75±0.25
0.48±0.26
7.81±0.04
2.98±0.24
1.24±0.28
2.40±0.05
, 百拇医药
8
3.75±0.25
0.53±0.14
7.08±0.03
2.98±0.24
1.36±0.17
2.19±0.04
表5 不同药物抑制2.2.15细胞分泌HBeAg的治疗指数
时间
(d)
肝丹
乙肝宁
, 百拇医药
TC50(mg/ml)
IC50(mg/ml)
TI
TC50(mg/ml)
IC50(mg/ml)
TI
5
3.75±0.25
0.47±0.23
7.98±0.03
2.98±0.24
, 百拇医药
0.92±0.14
3.24±0.04
6
3.75±0.25
0.35±0.12
10.71±0.04
2.98±0.24
0.85±0.27
3.51±0.09
3 2.2.15细胞的HBA-DNA复制规律 结果表明，2.2.15细胞培养第1d即可从培养上清中检出HBV-DNA，并可持续至第13d,其中以第5d～8dDNA条带荧光强度最强，表示其DNA含量最高，其复制规律与HBsAg、HBeAg分泌规律相似。
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4 不同药物对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用 结果见表2、表3；作用较强时期的IC50及TI见表4、表5。
5 不同药物对HBV-DNA复制的抑制作用 以当天不加药物2.2.15细胞上清经PCR扩增DNA条带荧光强度为++++，较之有减弱为++，不出现条带为-。不同药物对HBV-DNA复制的抑制作用结果见表6。 讨论
近几年，国内外不少学者对叶下珠抗HBV的作用进行了多方面的研究，反映不一，但也确取得了一些成绩[1，2]；近来国外有学者利用体外细胞模型进一步阐述了叶下珠抗HBV的机制，并证实了能降低HBV复制过程中HBsAg mRNA的水平[3，4]。
表6 不同药物对2.2.15细胞HBV-DNA复制的抑制作用
时间
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(d)
肝丹(mg/ml)
乙肝宁冲剂(mg/ml)
2.2.15
细胞
对照
阴性
血清
对照
2.0
1.0
0.5
0.25
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2.0
1.0
0.5
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为了动态观察临床应用效果良好的叶下珠复方肝康对HBV的作用情况，本项实验在细胞培养更换培养液方面与以往方法[2]有所不同，对体外抗HBV实验模型2.2.15细胞株的培养方式进行了改进，率先将细胞培养液的更换由每4d全部更换1次改为每天更换1/5，并每天对更换下来的培养液进行检测，连续动态观察13d，得到检测指标的动态曲线。这样的优点在于：一方面可以在实验期间动态保持培养液及药物浓度的一致性，又能符合临床上每天给药动态维持药物有效浓度的用药特点，另一方面每天更换下来用于检测的培养液不仅能反映HBV的复制或药物的抑制作用，而且所处条件一致具有很好的可比性，有利于从细胞生理、细胞凋亡等多个角度来分析问题。分析结果可以看出有如下特征：①均存在一个相似的药物作用曲线，即从开始用药到见到效果有个过程，需3d～4d，较强的抑制HBV作用可维持3d～5d，然后逐渐减弱、消失；②对照本实验方法的HBV分泌与复制规律可以看出，在HBV分泌、复制越是旺盛的时期，药物对HBV的抑制作用表现得越强，越能显示出药物的作用；③药物的作用具有呈正比的量效关系，即药效强弱与剂量大小有一定的依赖关系；由此可以说明肝康具有抗HBV的作用。
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从药物对HBsAg、HBeAg及HBV-DNA的影响来看，三者均有类似的作用曲线，看来它们存在着类似的作用规律，其内在的联系尚待进一步研究。
从本实验的药物作用曲线看，如何维持药物作用是个值得关注的问题，尚需从多方面进一步探讨，如：呈量效依赖关系时，每天药液更换量可否加大；细胞培养的实验设计作适当修改等等。
另外，从临床应用情况看，肝康对慢乙肝HBV复制指标(HBeAg、HBV-DNA)阳性的患者，具有促复制指标阴转的作用，能反映出其抗病毒效果，而对复制指标阴性者，除复制指标外其他变化不明显(即HBsAg阴转率不高)，这种HBV复制越明显越能反映抗HBV作用的临床疗效特征，看来与本实验的HBV分泌、复制越强，抗HBV的作用越明显的药物作用特点有一定关系。此外，干扰素在慢乙肝的临床应用中亦有类似的临床疗效特征，有关机制值得进一步多方探讨。
关于叶下珠体外抗HBV作用机制，有学者用2.2.15细胞模型对不同品种、剂型和添加剂成分的叶下珠提取物进行实验，发现药物对病毒颗粒产生的抑制不仅在转录前水平，可能对mRNA的翻译水平也有影响[5]。有学者提出中药体外抑制HBV的作用机理可能是作用于病毒的转录、翻译和蛋白合成等环节或直接与病毒蛋白结合而致HBsAg、HBeAg滴度下降[6]，那么肝丹是否如此尚需进一步研究。
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本项实验研究人体外抗HBV方面证实了：叶下珠复方“肝丹”具有抗HBV的作用。值得进一步研究与开发。
作者简介：王岭，女，38岁，主治医师，现就职于广州中医药大学附属珠海市中医院肝病科，从事肝病的临床与科研工作。参加了国家“八五”攻关项目及广东省中医药管理局课题的研究工作，主编了《中西医结合传染病学》等多本专著。
参考文献
1 王灵台，何燕，任家潍，等.苦味叶下珠抗乙肝病毒的临床研究.中西医结合肝病，1992，2(2)：6
2 陈征途，李凤仙，邓文娣，等.不同品种、不同产地叶下珠属植物在体外细胞培养中抗HBV作用的研究.中草药，1997，28(10)：616
3 Jayaram S,Thyagarajan SP. Inhaibition of HbsAg secretion from Alexander cell line by Phyllanthus amarus. Indian-J-Pathol-Microbiol, 1996, Jul; 39(3):211
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4 Lee CD, Ott M, Thyagarajan-SP, et al. Phyllanthus amarus down-regulates hepatitis B virus mRNA transcription and replication. Eur-J-Clin-Invest, 1996,Dec;26(12):1069
5 刘庄，傅希贤，张乃临，等.中草药叶下珠不同品种和制剂体外抗乙型肝炎病毒的实验研究.中华实验和临床病毒学杂志，1997，11(3)：282
6.范涛，傅希贤，张国庆，等.中草药抗乙型肝炎病毒活性及其作用机理体外实验研究.中 华实验和临床病毒学杂志，1996，10(1)：27
致谢：贵阳医学院李淑芳、左丽等老师为本实验研究做了大量工作，特致以谢忱!
(收稿日期 1999—02—03 修回日期 1999—04—10), 百拇医药