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编号:10280979
当归醇沉物对体外小鼠脾、胸腺淋巴细胞增殖的影响△
http://www.100md.com 《中草药》 1999年第2期
     作者:夏雪雁 彭仁臔

    单位:湖北医科大学药理教研室(武汉430071)

    关键词:当归醇沉物;淋巴细胞增殖;MTT比色法;氢化泼尼松

    中草药/990217摘 要 体外试验中,采用MTT比色法测定当归醇沉物对小鼠脾及胸腺淋巴细胞增殖功能的影响。结果显示,0.16~2.50 mg/mL 范围内的当归醇沉物能单独或协同ConA/LPS发挥促进小鼠脾脏及胸腺T、B淋巴细胞增殖的作用。当归醇沉物尚可对抗氢化泼尼松(HP)对ConA诱导的脾脏及胸腺T淋巴细胞的增殖反应的抑制作用。

    Effects of Chinese Angelica Tuber (Angelica sinensis) Ethanol Sediments

    on Mice Spleen and Thymus Lymphocytes Proliferation in vitro
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    Xia Xueyan and Peng Renxiu

    (Department of Pharmacology, Hubei University of Medical Science , Wuhan 430071)

    Abstract Sediment (ESA) obtained from the alcoholic precipitate of extract of tuber of Agelica sinensis(Oliv.) Diels in the preparation of Angelica injection was considered as a waste product. Its effect on lymphocyte proliferation of mice spleen and thymus was tested in vitro by MTT colorimetry. Results showed that at concentrations in the range of 0.16 ~2.50 mg/mL. ESA significantly promoted T、B lymphocyte proliferation either alone or with ConA/LPS, and can also antagonize hydroprednisone induced suppression of T lymphocyte proliferation in vitro.
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    Key words ethanol sediments from tuber of Angelica sinensis (Oliv.) Diels lymphocyte proliferation MTT colorimetry hydroprednisone

    当归Angelica sinensis Diels 是我国传统中药,除具有补血和血、调经止痛、扶正固本及活血化瘀等功效外,近年来研究已显示,当归及其提取物的多种组分均有免疫活性〔1,2〕。而在制备当归注射液的过程中,其醇沉物为废弃部分。为更全面认识当归的作用,我们选用当归醇沉物,通过体外试验观察其对小鼠脾脏及胸腺淋巴细胞增殖反应的影响。同时观察它对氢化泼尼松(HP)所致小鼠脾脏及胸腺淋巴细胞增殖反应抑制状态的调节作用。

    1 材料

    1.1 药品与试剂:当归醇沉物(ESA)由湖北医科大学附属第二医院制药厂提供。加入5倍量蒸馏水加热提取,浓缩后加入无水乙醇使醇终浓度为60%,静置取沉淀加水溶解,再加入无水乙醇使醇终浓度为80%,收获沉淀物,低温60 ℃干燥。所得深棕色粉末,用生理盐水溶解,2.986 kg、20 min高压灭菌。氢化泼尼松(HP),湖北制药厂。MTT、刀豆蛋白A(ConA)、细菌脂多糖(LPS)均为Sigma产品。RPMI 1640为Gibco 产品。
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    1.2 实验动物:Balb/c雄性小鼠,6~8周龄,体重18~22 g,湖北省医科院动物中心提供。昆明种雄性小鼠,8周龄,体重18~22 g,湖北医科大学实验动物中心提供。

    2 方法与结果

    2.1 ESA对小鼠脾/胸腺淋巴细胞增殖的影响:参照文献〔2〕,小鼠摘眼球放血,断椎处死。无菌取出脾/胸腺,制成淋巴细胞悬液。将此悬液用RPMI 1640完全培养液配成5×106/mL的淋巴细胞悬液,加入40孔板内,每孔50 μL,随后每孔加入用RPMI 1640稀释的不同浓度(0.16、0.31、0.63、1.25、2.50 mg/mL)的ESA液50 μL。另设培养液作空白对照。置37℃、5%CO2培养箱中培养48 h后,每孔加入5 mg/mL MTT液10 μL,继续培养4 h,加入10%SDS液(0.01mol/L HCl配制)每孔100 μL,置37 ℃恒温箱静置12 h。DG-3022A型酶联比色仪波长570 nm处测OD值,结果见表1。
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    ESA 0.16~1.25 mg/mL浓度范围内,可明显增强脾淋巴细胞的增殖,且0.16~0.63 mg/mL浓度范围内存在量效关系(r=0.9890),0.31~1.25 mg/mL范围内与对照组比较均有显著性差异(P<0.01)。ESA 0.16~0.25 mg/mL浓度范围内,可明显增强胸腺淋巴细胞增殖,且该浓度范围内存在量效关系(r=0.9920),0.31~2.50 mg/mL范围内与对照组比较均有显著性差异(P<0.01),说明ESA单独作用时对脾脏及胸腺淋巴细胞增殖均有促进作用。

    表1 ESA对小鼠脾/胸腺淋巴细胞增殖的影响(±s,n=4) 药品

    剂量

    (mg/mL)

    脾细胞OD
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    胸腺细胞OD

    RPMI1640

    -

    0.170±0

    0.137±0.015

    ESA

    0.16

    0.173±0.006

    0.170±0.017

    0.31

    0.190±0**

    0.180±0**
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    0.63

    0.200±0.010**

    0.190±0**

    1.25

    0.190±0**

    0.197±0.015**

    2.50

    0.173±0.012

    0.213±0.006**

    与RPMI 1640组比:**P<0.01
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    2.2 ESA协同LPS对脾B淋巴细胞增殖的影响:取Balb/c小鼠,同前法制备含LPS 50 μg/mL的5×106/mL的脾细胞悬液,加入40孔板内,每孔50 μL,每孔加入不同浓度的ESA液,并设置培养液及LPS作对照,其它同2.1,结果见表2。

    表2 ESA协同LPS对小鼠脾B淋巴细胞增殖的影响(±s,n=4) 药品

    剂量(mg/mL)

    脾细胞OD

    RPMI 1640

    -

    0.433±0.025
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    LPS 25 μg/mL

    -

    0.480±0.010*

    LPS 25 μg/mL+ESA

    0.16

    0.540±0.026

    0.31

    0.530±0.017

    0.63

    0.603±0.074

    1.25
, 百拇医药
    0.550±0.030

    2.50

    0.547±0.012△△

    与RPMI 1640组比:*P<0.05

    与LPS组比:P<0.05 △△P<0.01

    可见终浓度25 μg/mL的LPS能明显诱导脾脏B淋巴细胞的增殖反应,统计学处理有显著性差异(P<0.05)。ESA 0.16~2.50 mg/mL浓度范围内,均能协同LPS发挥促B淋巴细胞增殖的作用,其中以ESA 0.63 mg/mL时的作用最为明显,淋巴细胞增殖程度较LPS组升高126%,此后随着ESA浓度的升高,脾B淋巴细胞增殖作用不再增加。
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    2.3 ESA协同ConA对小鼠脾/胸腺T淋巴细胞增殖的影响:将脾/胸腺淋巴细胞制成含ConA 6 μg/mL的5×106/mL的细胞悬液,加入40孔板内。每孔50 μL,随后每孔加入不同浓度的ESA液,并设置培养液及ConA作对照,其它同2.1,结果见表3。

    可见ConA终浓度为3 μg/mL能明显诱导脾脏及胸腺T淋巴细胞的活化、增殖,表3 ESA协同ConA对小鼠脾/胸腺T淋巴细胞增殖的影响(±s,n=4) 药品

    剂量

    (mg/mL)

    脾细胞OD

    胸腺细胞OD

, 百拇医药     RPMI 1640

    -

    0.170±0

    0.137±0.015

    ConA3 μg/mL

    -

    0.187±0.006* *

    0.163±0.006*

    ConA3 μg/mL

    +ESA

    0.16

    0.180±0
, 百拇医药
    0.173±0.006

    0.31

    0.190±0.010

    0.190±0.034

    0.63

    0.197±0.015

    0.187±0.012

    1.25

    0.203±0.006

    0.203±0.015

    2.50
, 百拇医药
    0.197±0.006

    0.200±0.010△△

    与RPMI 1640组比:*P<0.05 **P<0.01

    与ConA 组比:P<0.05 △△P<0.01

    统计学处理有显著性差异。ESA能协同ConA发挥促脾脏及胸腺T淋巴细胞增殖的作用,其中以ESA浓度为1.25 mg/mL时作用最为显著。在0.16~2.50 mg/mL浓度范围内,对脾脏及胸腺T淋巴细胞增殖均存在量效关系(r=0.8452及r=0.8912)。

    2.4 ESA协同ConA对抗HP对小鼠脾/胸腺T淋巴细胞增殖的抑制:将脾/胸腺淋巴细胞制成含 ConA 6 μg/mL、HP 0.05 μg/mL的5×106/mL的细胞悬液,加入40孔板内,每孔50 μL,随后每孔加入不同浓度的ESA液,并设置ConA及ConA+HP作对照,其它同2.1,结果见表4。
, 百拇医药
    表4 ESA协同ConA对抗HP对小鼠脾/胸腺T细胞增殖的抑制(±s,n=4) 药品

    剂量

    (mg/mL)

    脾细胞 OD

    胸腺细胞 OD

    ConA 3 μg/mL

    -

    0.187±0.006

    0.163±0.006

    ConA 3 μg/mL+
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    -

    0.170±0**

    0.143±0**

    HP0.025 μg/mL

    ConA 3 μg/mL+

    0.16

    0.177±0.006

    0.160±0△△

    HP0.025 μg/mL

    0.31

    0.180±0△△
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    0.153±0.025

    +ESA

    0.63

    0.193±0.006

    0.197±0.038

    1.25

    0.187±0.011

    0.163±0.006

    2.50

    0.200±0.010△△

    0.187±0.006△△
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    与ConA组比:**P<0.01

    与ConA+HP组比:P<0.05 △△P<0.01

    HP终浓度为0.025 μg/mL能明显抑制ConA诱导的脾脏及胸腺T淋巴细胞的增殖(P<0.01),使淋巴细胞增殖程度下降,分别为ConA组的91%和88%。ESA能对抗HP的抑制作用在0.16~2.50 mg/mL浓度范围内,ESA的对抗HP对脾淋巴细胞增殖的抑制作用随着浓度的增加而增强。而ESA对抗HP对胸腺淋巴细胞增殖的抑制作用的浓度-效应现象则不似对脾细胞作用典型,其中ESA 1.25 mg/mL时使胸腺淋巴细胞增殖升高138%。

    3 讨论

    从当归热水提取物中所得到的当归免疫活性多糖(AIP)为小鼠B淋巴细胞的潜在丝裂原,且可使部分细胞群成熟为抗体分泌细胞〔4,5〕。本实验所用的系当归水煮醇沉物,体外试验对经特异性B淋巴细胞有丝分裂原LPS活化及未经活化的小鼠脾细胞均有促进增殖的作用,我们在实验中,曾观察到ESA可对抗HP对抗绵羊红细胞抗体生成功能的抑制,因此本结果表明当归醇沉物同样具有激活B淋巴细胞并使之分化为抗体分泌细胞的作用。
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    吴梧桐等观察到在ConA存在时,当归和其中单体成分阿魏酸均能明显地促进活化的淋巴细胞DNA及蛋白质的合成〔2〕。本实验结果显示,当归醇沉物对ConA活化的小鼠脾及胸腺T淋巴细胞也有促进增殖作用,进一步说明当归及其提取物有增强活化的T细胞增殖的作用。糖皮质激素为免疫抑制剂,据认为它对胸腺细胞的抑制作用与其诱导免疫细胞的程序性死亡有关〔6,7〕。本文所见当归醇沉物对抗HP所致T淋巴细胞增殖反应的抑制的原因将有待阐明。此外该醇沉物单独对未经活化的小鼠胸腺淋巴细胞有活化和促进增殖的作用,且存在量效关系,这一点尚少见报道。

    中药制剂的免疫活性作用常表现出复杂的量效关系,有时只存在一个最适剂量〔8,9〕。本实验中可见,当归醇沉物0.63 mg/mL时,协同LPS对脾B淋巴细胞增殖的促进作用 亦表现这样的特点。与此同时,当归醇沉物在一定浓度范围内(0.16~2.50 mg/mL),对胸腺淋巴细胞增殖存在量效关系。因此,寻找药物发挥免疫作用的最适剂量,成为研究工作中的一个关键。
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    当前从传统中药中提取有效单一成分,已越来越受到人们的关注。然而本文所观察到的是当归水煮醇沉物的免疫活性,它从另一个侧面提示了在反映中药的药理活性中,应全面认识其不同组分的综合作用的结果。

    *Address:Xia Xueyan,Department of Pharmacology,Hubei University of Medical Sciences,Wuhan

    作者简介:夏雪雁 1994年毕业于湖北医科大学临床医学专业,获医学学士学位。1994-1997年攻读湖北医科大学生化药理专业硕士,并获得硕士学位。1997年参加第六届全国生化药理学术讨论会青年优化药理学术讨论会青年优秀论文评选并获得三等奖。1997年至今任湖北医科大学药理教研室助教。

    △湖北省教委资助项目;本文获第六届全国生化药理学术讨论会青年优秀论文三等奖
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    参 考 文 献

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    (1998-04-20收稿), http://www.100md.com